Sneller van idee naar eiwit. Zo haal je het maximale uit je workflow

Klassieke celgebaseerde eiwitexpressie kost veel tijd. Je bent vaak meerdere dagen bezig met kloneren, transformeren, expressie en zuivering. Daarnaast kunnen sommige constructen in cellen toxisch zijn, waardoor je workflow vastloopt.

Met cell free protein synthesis (CFPS) gaat dit veel sneller. Door DNA eerst te assembleren en vervolgens direct in een celvrij systeem te gebruiken, kun je dezelfde dag al eiwitten maken. Dat maakt snelle screening van varianten mogelijk en is ideaal voor synthetische biologie en eiwitengineering.

In deze blog laten we zien hoe je met een gestroomlijnde cell free workflow van ontwerp tot gezuiverd eiwit gaat. Deze aanpak verkort de traditionele celgebaseerde workflow van zeven dagen naar één dag en is uitstekend geschikt voor automatisering, hogere doorvoer en meer productiviteit.

1. Ontwerp je constructen slim

New England Biolabs (NEB) biedt gratis tools die het ontwerpproces eenvoudig maken. Denk aan:

• NEBuilder Assembly Tool voor HiFi assemblage

• NEBridge Golden Gate Assembly Tool voor Type IIS gebaseerde ontwerpen

• NEBridge Ligase Fidelity Tools voor complexe, modulaire projecten

Deze tools helpen bij primerontwerp en verhogen je kans op succesvolle assemblage.

2. Maak en zuiver je DNA

Gebruik PCR amplicons of geknipte DNA fragmenten en zuiver je DNA voor de beste resultaten, bijvoorbeeld met Monarch PCR & DNA Cleanup kits van NEB. Hoogwaardige input is essentieel voor stabiele assemblage en expressie.

3. Assembleer je DNA

Afhankelijk van je project kies je:

• NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix voor naadloze assemblage en parallelle varianten
• NEBridge Golden Gate Assembly Kit voor snelle, modulaire montage van 2 tot meer dan 50 fragmenten

Deze high fidelity en high efficiency assemblagemethoden leveren producten op die direct gebruikt kunnen worden in Rolling Circle Amplification (RCA), waarna ze als template dienen voor Cell-free Protein Synthesis (CFPS).

NEBuilder HiFi DNA Assembly is geschikt voor naadloze DNA assemblage ongeacht fragmentlengte of eindcompatibiliteit. De methode is zeer accuraat, waardoor parallelle assemblages eenvoudig opgeschaald kunnen worden. Ideaal voor het prototypen van eiwitvarianten voor engineering en screening.

4. Vermeerder je DNA met RCA

Voor CFPS heb je vaak meer DNA nodig. Met Rolling Circle Amplification kun je binnen 2 uur grote hoeveelheden circulair DNA maken. Alleen succesvol geligeerde constructen worden versterkt.

5. Cell-free Protein Synthesis (CFPS)

Met het NEBExpress Cell free E. coli Protein Synthesis System kun je binnen 2 tot 4 uur eiwitten maken, inclusief moeilijke of toxische eiwitten. Het systeem is schaalbaar en geschikt voor automatisering.

6. Zuiver je eiwit

Gebruik magnetische beads van NEBExpress Ni NTA, SNAP Capture of amylose beads om His tag, SNAP tag of MBP fusies snel te isoleren. Dit werkt zowel voor kleine volumes als voor hoge doorvoer.

Waarom deze workflow werkt

• van dagen naar uren

• ideaal voor variant screening

• compatibel met automatisering

• kostenverlagend bij miniaturisatie

• werkt ook voor uitdagende eiwitten

Voor de volledige Engelstalige blog kun je terecht op de NEB website.